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ELISA样本制备指南及注意事项
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定义及介绍
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。
样本制备指南
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血清
全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品
2.血浆
抗凝剂推荐使用EDTA-Na
2，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。
3组织匀浆/组织全蛋白
用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。
其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。
4.细胞提取液
贴壁细胞
用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；
悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10
6个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。
其余方法：
对于
贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。
对于
悬浮细胞：离心收集细胞，以2×10
6细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10
5细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
5.细胞培养上清或其他生物体液
收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。
实验细节与注意事项
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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。
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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。
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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。
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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。
对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：
稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；
稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；
稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；
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每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。
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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。
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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。
如今，想生娃却怀不上，成为不少育龄家庭的困扰。近日，北京市宣布将16项辅助生殖技术（辅助生殖技术是应用医学技术对配子（卵子和精子）和胚胎进行体外人工操作，帮助不孕夫妇实现生育的技术，主要包括人工授精、体外受精-胚胎移植及其衍生技术）项目纳入医保甲类报销，打响了辅助生殖迈入医保的“第一枪”。此举引起社会热议：不孕不育家庭的负担能减轻多少？医保支付后能否提高生育率？
16项辅助生殖纳入医保
最高可节省14000元
近日，北京市医保局会同北京市卫生健康委、北京市人力社保局下发《关于规范调整部分医疗服务价格项目的通知》，将门诊治疗中常见的宫腔内人工授精术、胚胎移植术等16项辅助生殖技术项目纳入医保甲类报销范围。根据《通知》要求，今年3月26日新政策将正式落地。
这意味着，北京市成为全国第一个将辅助生殖技术纳入医保的地区。
根据《通知》要求，这一政策自3月26日起执行，适用于北京市15家具有辅助生殖资质的基本医疗保险定点医疗机构，非公立医保定点医疗机构则参照执行。
相关医疗服务价格显示，纳入医保甲类报销范围的辅助生殖技术的项目价格从180元到5050元不等，项目类型涵盖人工授精、胚胎移植与培养等多种医疗服务。
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有媒体报道称，医保政策落地后，从实验室的胚胎培养到胚胎移植这个周期的治疗大约将节省10000元到14000元不等。
辅助生殖有多贵？
三代试管婴儿单周期超十万
根据国家卫健委2021年发布的信息显示，我国不孕不育发病率为7%-10%，有不到20%的患者需要接受辅助生殖技术治疗。
在辅助生殖的技术中心，需求量最大的就是试管婴儿技术，但试管婴儿治疗的收费项目多且昂贵、周期时间长，让不少家庭望而却步。
家在广州的茉莉今年32岁，结婚5年还没有生娃，她和丈夫走上了试管婴儿的道路。“已经尝试了两次，前前后后花了十来万。”去年年底，茉莉第三次进行试管婴儿的治疗，终于得到了成功受孕的喜讯。
多位曾经接受试管婴儿治疗的家庭表示，在目前尚未纳入医保的地区，一代、二代试管婴儿单周期治疗大概需花费3至5万元，三代试管婴儿的费用更高，每个周期治疗费用甚至达到十几万元。
单周期价格对于不少家庭来说已经较为昂贵，不少患者甚至需要两次或两次以上周期才能受孕成功。
广东省人民医院妇产科生殖科主任医师王海英在接受采访时表示，做一次试管，大概是花4万元的水平。主要的费用包括一些辅助生育前的身体评估，是否有遗传病、是否能够生育等身体检测，还包括促排卵的药物、取卵的费用、胚胎的培养，胚胎的移植。
辅助生殖迈入“医保支付”
生育率能否提高？
近年来，将辅助生殖技术纳入医保的呼声并不鲜见，不少不孕不育家庭也翘首以待。
事实上，去年9月，国家医保局在答复人大代表建议时表示，国家医保局将指导各地，立足“保基本”的定位，在科学测算，充分论证的基础上，逐步把医保能承担的技术成熟、安全可靠、费用可控的治疗性辅助生殖技术按程序纳入医保支付范围。
有专家表示，北京作为首个将辅助生殖技术项目纳入医保的地区，相关措施的实施将对全国其他地方起到引领和示范作用。
国务院发展研究中心研究室主任冯文猛表示，从去年开始，很多政策出台提供了一个非常好的示范，这对于解决大的生育问题，让更多的人想生孩子能生出来，进而提升生育水平，提供了一个良好的助推。
全国人大代表、山东中医药大学第二附属医院生殖医学科主任医师孙伟表示，试管婴儿给患者带来的经济负担是比较重的，所以如果其中一些项目纳入医保帮助患者减轻负担，或许能够帮助刺激生育意愿。
但也有专家对这一措施能否提高生育率持较为审慎的态度。中山大学附属第一医院生殖中心专科主任徐艳文说：“已经生了二孩的妈妈来咨询生三娃比较少，来的主要是已经有胚胎冷冻在生殖中心的患者。”
徐艳文表示，再生一个孩子关乎的不仅仅是生育这个环节本身，还关乎养育、教育等多个环节，这也是许多家庭考虑是否再生育的重要因素。
专家提醒
这些事不容忽视
据国家卫健委妇幼健康司信息，不孕不育患者中约70%-80%可通过生活方式指导、心理疏导、药物治疗等措施获得妊娠，另有约20%需要借助辅助生殖技术。
此前，有研究者称，经辅助生殖技术生育的孩子可能存在一些健康风险。首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科主任杨晓葵表示：“自1978年世界上首例试管婴儿诞生以来，人类辅助生殖技术已走过40余年历史，全世界已有800余万辅助生殖子代出生，在发达国家，辅助生殖技术出生的子代占出生婴儿人数的2%-5%。总体来看，试管婴儿的宝宝和自然怀孕的宝宝从目前统计学数据看没有显著区别。当然，不断优化辅助生殖技术、加强对子代随访和安全性的长期评估，以及对出生缺陷的防控是我们要持续开展的工作。”
专家表示，一些妇产医院会为实施辅助生殖助孕患者提供孕前指导、不孕症评估、辅助生殖助孕、多学科协作等个性化医疗服务，助孕成功后开展全孕期产检、优质分娩等全链条服务。
杨晓葵说：“科普也不容忽视。比如合理饮食、科学运动、孕前补充叶酸，尽量在25-30岁期间怀孕等。此外，在生殖专科进行卵巢功能评估，了解自身卵巢储备功能对生育非常重要。” 据中新网、科技日报等
【来源：华商报】
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